奶牛乳房炎診斷技術的研究進展

摘  要：奶牛乳房炎是影響奶牛生產的主要疾病之一。病原菌的免疫抑制以及日趨嚴重的耐藥性，致使乳房炎的發病率增高且治愈困難，給世界奶牛養殖業造成了巨大的經濟損失。實踐表明，疾病的診斷是疾病病因和治療之間較重要的一步。經濟、快速、可靠的診斷工具是乳房健康管理的基礎。本文主要論述了奶牛乳房炎不同診斷方法的優缺點以及新興診斷技術的研究進展。
關鍵詞：奶牛；乳房炎；病原菌；診斷
奶牛乳房炎又稱奶牛乳腺炎（Bovine mastitis），是奶牛乳腺受到物理、化學或微生物等刺激所發生的一種炎癥反應，其發生范圍廣、發病率高。據報道，在一些國家，每頭奶牛因乳房炎造成的經濟損失達107~344美元[1]，所以奶牛乳房炎的控制和治療策略尤為重要，其中，致病病原體的鑒定是至關重要的基礎。引起奶牛乳房炎的致病菌包括細菌、真菌、病毒等，但一般以細菌為主。據報道，在奶牛乳房炎病例中已鑒定出130多種不同的微生物[2]。引起奶牛乳房炎的細菌可分為環境型（大腸桿菌、克雷伯氏菌屬和綠膿桿菌等）和傳染型（金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、化膿性假單胞菌和支原體屬等）。90%以上的乳房炎是由金黃色葡萄球菌、鏈球菌以及大腸桿菌引起[3]。特別是金黃色葡萄球菌，它是引起奶牛乳房炎較重要的病原菌，在全球各地的奶牛場均普遍存在。金黃色葡萄球菌免疫抑制較強，多在泌乳高峰期感染奶牛，感染的牛只多為慢性發病，但有時也會急性發病，因治愈困難、復發率高，給奶牛場帶來嚴重的經濟損失[4]。
1、奶牛乳房炎的診斷方法
奶牛乳房炎通常分為兩類：臨床型乳房炎和亞臨床型乳房炎（即隱性乳房炎）。由于臨床型乳房炎眼觀明顯，所以本文僅對亞臨床型乳房炎診斷展開論述。
傳統的亞臨床型乳房炎檢測方法存在耗時長、假陰性結果較多且靈敏度低下等不足。尤其作為乳房炎鑒定的黃金標準——微生物培養，雖然對生物體在抗生素的選擇使用方面具有許多優勢，但對于密切相關的病原菌鑒定卻不是很準確。據Makovec等[5]報道，該方法的變異性較大，在乳房炎乳汁樣品的微生物培養中產生了27%~50%的假陰性。正因為這些傳統方法的不足，國內外許多學者開展了大量新研究，希望能夠更好地完善奶牛乳房炎診斷技術。目前，紅外技術、生物傳感技術以及納米技術等新技術已相繼應用到該領域，但尚未完全成熟，需要進一步的研究及驗證才可應用到實際。在新興技術中，實時熒光多重PCR在人醫和獸醫領域都頗受歡迎。該技術檢測快速、結果準確，具有高特異、高靈敏度等特點，就目前來看是當前奶牛乳房炎診斷較合適的替代方案。
紅外技術
據Johnzon等[6]研究表明，炎癥反應與乳房炎致病因子的毒力相關，但要進一步研究才能找到促炎因子與乳腺炎的關系。Schabauer等[7]報道，傅里葉變換紅外（FTIR）光譜技術基于對生物體DNA的識別，通過物種的光譜與參考數據庫中已知物種的光譜進行比較，可以區分密切相關的物種。此外，FTIR光譜學還被證明是一種適用于流行病學調查和追蹤污染源的工具[8~10]。研究表明，一旦建立并安裝了基于該技術的系統，就可以準確且低成本地檢測出乳腺病原體，從而可以更早地對臨床型乳房炎進行診斷與治療。目前，這項技術在獸醫臨床診斷中受到越來越多的關注。Martins等[11]為了尋求簡單可靠的檢測指標，通過紅外熱像儀（ITR）進行監測，證明了亞臨床型病例與健康奶牛相比具有更高的乳房溫度。溫度反映了組織代謝和血液循環的狀態，異常的熱模式表示淺表炎癥或循環障礙的區域。ITR監測紅外輻射發射的表面熱量，而熱成像儀吸收紅外輻射并根據產生的熱量生成圖像[12]。在捕獲圖像前，將相機校準到環境溫度且將溫度測量值調整為攝氏度，在距離乳房1.0m于擠奶前采集乳房的熱像圖像，記錄下乳房表面較高溫度進行分析，從而對患畜與健康牛只進行分類。據研究表明[13]，紅外熱像儀的敏感性和特異性分別為95.6%和93.6%。雖然其敏感性和特異性很高，但在實際操作中卻很費力，且阻礙較多，還有待進一步的研究。
生物傳感技術
在診斷領域，我們不能忽視在乳房炎發病前或治療前的奶牛行為變化。Avery綜合研究結果顯示，奶牛在采食量和總體活動方面變化顯著，這些變化在臨床癥狀出現前幾天就很明顯，所以可作為監測的指標[14]。為此，Stangaferro等[15]開發了一種可以記錄反芻動物活動與自身健康的自動監測系統，當與其他傳統診斷結合使用時，被證明是有效的方法，但需要在管理領域取得進一步進展才能較大限度地發揮效益。Yazdanbakhsh等[16]開發了動物傳感器與智能監控相關聯的系統，該系統在疾病發作前幾天就可以對奶牛進行疾病的監測。然而，常規使用需要進一步推進它的高度特異性和敏感性。Zhang等[17]整合了電子動力學和生物傳感技術，有助于達到耗時短、靈敏度高的目的。Ganda等[18]發現其易于執行，結果準確，實際結果與16S rRNA測序結果相當。隨著該系統的進一步發展，用于乳房炎診斷將在牧場中變得更加可行，特別是在診斷與乳房炎相關的微生物群體上，可以觀察到具有不同疾病狀態和疾病史乳頭的細菌群落的顯著差異。通過采取預防措施，可以改善牛群的健康狀況，從而提高農業生產力和動物福利。
Chinnappan等[19]開發了基于磁性納米顆粒的量熱測定法用于檢測乳中的纖溶酶水平。纖溶酶是一種熱穩定的內源性絲氨酸蛋白酶，無論涉及何種病原體，它都會釋放出來[20,21]。隨纖溶酶水平的增加，底物被切割，肽片段附著在磁性物上的珠子將被傳感器下面的磁鐵吸引，露出金色表面。研究發現，金色表面的面積與纖溶酶活性成正比。因此，該方法主要就是通過比色分析來區分健康牛與患牛。這種比色生物傳感器反應快速、簡單、敏感，在乳腺炎診斷過程中有很強的潛力且可能用作初始階段的診斷。Peedel和Rinken[22]設計了另一種用于快速檢測金黃色葡萄球菌的生物傳感器。它由可再生的微柱和用于選擇性結合靶細菌的二抗和共軛熒光標記物組成。Duarte等[23]基于磁性納米粒子與特異性抗體的結合特性，采用具有微流體樣品的磁阻細胞儀檢測金黃色葡萄球菌，與常規方法相比，提高了效率。
蛋白質組學分析
基于基因分析的乳房炎診斷方法正變得越來越頻繁。基因分析可用于測試已從牛奶中分離的細菌，或直接檢測其在牛奶中的存在[24]。當代科學用可以識別乳腺炎癥狀的生物標志物設計新的診斷測試，以快速檢測出乳腺感染，而蛋白質組學分析就是這些工具之一[25,26]。研究表明，亞臨床型乳房炎乳清中的蛋白質表達模式較健康牛只發生了改變[27]。急性期蛋白（APP）是在急性炎癥反應期間在肝臟中構建的蛋白質，在正常狀態下較低，但在各種炎癥的刺激下會迅速升高，而當病愈或得到有效治療時其水平又會立即恢復正常。反芻動物較為敏感的急性期蛋白是結合珠蛋白（HP）和血清淀粉樣蛋白A（SAA），這兩者在急性炎癥發生時會大量增加。有研究指出，乳汁中SAA的增加較為明顯[28]。Hussein等[29]則研究發現MAA（乳淀粉樣蛋白A）優于其他亞臨床型乳房炎診斷標志物，優勢在于健康動物乳汁中微量甚至檢測不到的MAA水平，它不受乳房炎以外的其他因素的影響，并且可以在保存的樣品中估計，為臨床型乳房炎的診斷提供了有力的證據。Mansor等[30] 報道，這些生物標志物可以作為準確區分健康和患病狀態的潛在候選者，并能提供有關致病因子的一些信息。在較近報道的一項研究中，使用無標記定量的方法可以確定由乳房鏈球菌引起的乳中蛋白質表達的相對變化，與先前的報道相比，已經證明它更有利并且能夠提供關于宿主對奶牛乳房炎更全面的信息[31]。
分子診斷
分子診斷是用于檢測常規方法難以檢測的乳房炎病原體物種的一項檢測技術，包括LAMP、PCR和多重實時PCR等技術。這些基于核酸的檢測依賴于各種病原體的基因組序列。LAMP技術由Notomi等人開發，它是一種新型的DNA擴增方法，可以在等溫條件下擴增靶基因[32] Sayad等[33]研究發現，LAMP（環介導）具有鈣黃綠素介導的量熱無線檢測系統，可在65min內有效檢測病原體，尤其適用于金黃色葡萄球菌的快速檢測。環介導等溫擴增技術反應快速、經濟、耗時短，其局限性主要是靈敏度低。在過去幾年中，它在診斷領域獲得了很大的普及，很有潛力被用作現場檢測，但在靈敏度的改良上仍然需要國內外學者的共同努力。
與其他檢測技術相比，PCR（聚合酶鏈式反應）診斷技術的特異性和敏感性優勢十分顯著，是目前奶牛乳房炎臨床診斷中比較先前的一種分子水平檢測方法，Phuektes等[34]建立的一種以16S~23SrDNA間隔區為擴增靶序列的多重PCR檢測方法，依據16S~23SrDNA在不同種的細菌中拷貝數、長度、堿基排列順序及含有的tRNA基因的數量和種類不同，可判斷致病菌的種類。PCR不僅可以檢測細菌的種類和重要的抗生素抗性基因，還可以檢測霉菌和病毒，也可用于混合培養傳統 PCR的缺點是在DNA擴增檢測中使用瓊脂糖凝膠，其分辨率非常差[35]。而多重實時PCR則在傳統PCR的基礎上進行改進，通過熒光定量分析儀對提取的DNA進行擴增，經過50℃、3min去污染，95℃、3min預變性，95℃、10S擴增和60℃、40S退火等40個循環，根據分析軟件的Ct值就可以客觀地解釋各致病菌種的陽性結果。Mahmmodp等[36,37]報道，奶牛乳房炎致病菌陽性結果的數量與Ct值截止值的選擇相關，與劑量反應效應相當。現國內少數地區已使用該項檢測技術監控亞臨床型乳房炎，如上海就是通過PathoProof乳房炎多重PCR診斷系統對單一反應孔16種重要的病原菌進行基因診斷。該16聯牛乳房炎病原菌核酸檢測采用TaqMan探針實時熒光PCR技術，針對引起牛乳房炎常見的病原菌特有的DNA保守區域設計特異性引物和TaqMan探針，通過PCR擴增觀察是否產生級聯放大熒光信號可快速準確地檢測牛奶樣品中引起奶牛乳房炎的病原菌種類。多重PCR主要用于常見的炎癥病原體，與傳統培養相比，PCR診斷技術敏感性高、特異性強、檢測方便、耗時短且結果更加準確。
2、展望
近幾年來，奶牛養殖行業發展迅速，規模不斷壯大，但隨之而來的疾病也在不斷高發，僅乳房炎就給牧場造成巨大的經濟損失。國內外許多學者為了更好地診斷和維護乳房的健康，在生物傳感器技術領域做了很大的投入，并取得了相當大的進步，特別是基因組學和蛋白質組學方法的結合，以及納米治療技術和其他傳感器的進一步參與，將有助于尋求更好的乳房炎診斷工具。就目前的診斷方法而言，多重實時PCR檢測，反應快速、結果準確且特異性強、靈敏度高，是當前用于奶牛乳房炎診斷的較合適的替代方案。當前，雖然奶牛乳房炎診斷技術不斷進步，成果頗多，但推廣力度始終不夠。所以為了突出這些技術在奶牛行業的影響，應該提供更多的理論知識和指導來傳遞這些新穎的先進技術，使這些技術不僅僅只局限于少數實驗室，而是能真正走進各大牧場，走進奶牛行業。